新西蘭胎牛血清(SFBS)

產(chǎn)品名稱：新西蘭胎牛血清

貨號：SFBS

規(guī)格：500ml

品牌：BOVOGEN

細(xì)胞培養(yǎng)最基本的是做好污染防控，包括微生物污染的防控和細(xì)胞系間交叉污染的防控。

實(shí)驗(yàn)中需保持良好的操作習(xí)慣，所用材料的位置擺放要順手，污染源和已滅菌物品要分開放置。實(shí)驗(yàn)室也需定期清潔與消毒。

※血清與培養(yǎng)基

通常血清的添加比例為10%，當(dāng)然也可根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和生長速率適當(dāng)增加或減少添加比例。在更換血清品牌或者批次時(shí)，最好需對血清的品質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，防止對實(shí)驗(yàn)造成影響。

對于培養(yǎng)基，目前商品化的比較成熟，穩(wěn)定性也較好。如若需自配培養(yǎng)基時(shí)，過濾前攪拌時(shí)間不宜過長（培養(yǎng)基中營養(yǎng)豐富，細(xì)菌常溫下20min就可繁殖一代，其代謝產(chǎn)物會(huì)對培養(yǎng)基的品質(zhì)產(chǎn)生影響）。培養(yǎng)基過濾除菌后，應(yīng)對培養(yǎng)基進(jìn)行無菌驗(yàn)證，防止污染。

※細(xì)胞培養(yǎng)瓶

目前商品化的細(xì)胞培養(yǎng)瓶主要為瓶蓋是否帶氣孔兩種。其中不帶透氣孔細(xì)胞培養(yǎng)瓶擰緊后需適當(dāng)回旋瓶蓋，保證CO2能順利進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

細(xì)胞培養(yǎng)過程中，對于適應(yīng)能力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞，可在傳代3-4次后更換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。對于非腫瘤細(xì)胞系如293T，HEK293等細(xì)胞，建議每次傳代更換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶來保證細(xì)胞狀態(tài)。

※細(xì)胞傳代

正常細(xì)胞形態(tài)較好，輪廓清晰，邊緣透亮，細(xì)胞增殖狀況良好。當(dāng)貼壁細(xì)胞長到密度90%時(shí)，需進(jìn)行傳代。

傳代時(shí)通常使用胰酶消化法。該方法又分為干消化法和濕消化法。

干消化法：胰酶浸潤后棄去胰酶，待細(xì)胞變圓后加入新鮮培養(yǎng)基吹下后再進(jìn)行細(xì)胞傳代。

濕消化法：待細(xì)胞變圓，肉眼觀察下成流沙狀脫落時(shí)即可加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，1000rpm離心5min,棄去上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸傳代。

吹打細(xì)胞時(shí)，手法要輕柔，避免吹打出氣泡，造成細(xì)胞因內(nèi)外壓差破裂，同時(shí)需避免刮到瓶壁影響細(xì)胞的貼壁。

不同細(xì)胞的貼壁能力不同，消化時(shí)間不同；不同細(xì)胞細(xì)胞間連接強(qiáng)度不一樣，消化時(shí)間不同；同一細(xì)胞生長狀狀況不同，消化時(shí)間不同。消化時(shí)適時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)，避免因過度消化影響細(xì)胞活性。

傳代間隔時(shí)間和傳代比例因細(xì)胞而異。細(xì)胞傳代過程中，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)狀態(tài)不好或者污染時(shí)及時(shí)棄去細(xì)胞，重新復(fù)蘇。

※細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

當(dāng)細(xì)胞生長狀況較好或者代數(shù)較早時(shí)，需及時(shí)大量的凍存。

細(xì)胞凍存液比例為培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1，也可血清：DMSO=9:1。細(xì)胞凍存密度通常為1-3×106個(gè)/ml。細(xì)胞凍存采用慢凍方式，減少冰晶形成，避免細(xì)胞損傷。通常4℃放置0.5 h，-20℃放置2 h，-80℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)升溫要快，防止在解凍過程中水分進(jìn)入細(xì)胞，形成冰晶，影響細(xì)胞存活。38℃水浴不時(shí)搖動(dòng)，在1分鐘內(nèi)使其*融化，1000rpm離心5min,棄去上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸移入培養(yǎng)瓶中。

※用真誠感動(dòng)細(xì)胞

俗話說，心誠則靈。對待細(xì)胞培養(yǎng)也應(yīng)如此，“自己要用的細(xì)胞自己養(yǎng)"，多去觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

所謂“知彼知己，百戰(zhàn)不殆"。培養(yǎng)細(xì)胞需要我們的耐心以及不斷的摸索和積累，了解了每種細(xì)胞各自的習(xí)性后，再“傲嬌"的細(xì)胞也能在我們的“真誠"下認(rèn)真“成長"※※※※

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貼壁細(xì)胞傳代：

1）移棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)液。（不要直接倒掉，避免瓶口殘留導(dǎo)致易污染）

2）使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液（PBS）沖洗細(xì)胞。從與貼壁細(xì)胞層相對的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液，以避免攪動(dòng)細(xì)胞層，前后搖晃容器數(shù)次，最后移棄沖洗液。（洗去殘留的血清，避免影響胰酶的活性。）

3）以 25 cm2的培養(yǎng)瓶為例，向瓶內(nèi)加入1ml胰蛋白酶-EDTA（請根據(jù)各細(xì)胞的指引使用合適的濃度）消化液，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，幾分鐘內(nèi)，會(huì)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，傾斜培養(yǎng)瓶時(shí)細(xì)胞層能自然流下，此時(shí)應(yīng)加入2-3ml含血清的*培養(yǎng)液終止消化（細(xì)胞解離所需時(shí)間請參考各細(xì)胞的指引，并建議每隔30秒在顯微鏡下觀察細(xì)胞的解離情況）。另外，并不是所有貼壁細(xì)胞都適用采用胰蛋白酶進(jìn)行解離，請根據(jù)各細(xì)胞的指引選擇合適的解離方法。

4）使培養(yǎng)瓶傾斜，吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)液體輕輕沖向原細(xì)胞生長表面，重復(fù)該動(dòng)作2-3次，使所有細(xì)胞沿瓶底流下，再輕柔地把細(xì)胞吹打成單個(gè)懸液（吹打過程中應(yīng)避免氣泡的產(chǎn)生）。

PS：對于難消化的細(xì)胞，盡量不要通過用力吹打的方式來處理，以免對細(xì)胞產(chǎn)生物理損傷?？梢韵葘⒁呀?jīng)消化的細(xì)胞分出來，及時(shí)終止消化。然后再對仍然貼壁的細(xì)胞進(jìn)行再次消化。做到分層消化，避免易消化細(xì)胞長時(shí)間在胰酶消化下受損。

5）把所有的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后移棄上清。

6）加入新的含血清*培養(yǎng)液重懸成單細(xì)胞懸液。按各細(xì)胞指引推薦的傳代比例，把細(xì)胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中，補(bǔ)足新的含血清*培養(yǎng)液，輕輕搖晃混勻。

7）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁情況。

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9、如何區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞?

顯微鏡下觀察：活細(xì)胞中間透亮，飽滿，有光澤，死細(xì)胞較暗。也可以通過臺(tái)盼藍(lán)染色來計(jì)算細(xì)胞活力。

10、如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞?

用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200～2000 個(gè)/毫升，在0.1 毫升的細(xì)胞懸液中加入0.1 毫升的0.4%的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞?；罴?xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞，注意計(jì)數(shù)需在加入臺(tái)盼藍(lán)10min內(nèi)完成。有細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的，可直接用計(jì)數(shù)儀進(jìn)行。

11、二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎?

二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。

12、使用胰蛋白酶加入EDTA是為什么?

EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。

13、可否使用與原先不同的培養(yǎng)基?

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，易造成細(xì)胞狀態(tài)不好，最終造成細(xì)胞無法存活。

14、可否使用與原先不同的血清種類?

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無法存活。

15、細(xì)胞為何生長不均勻?

細(xì)胞傳代后放入培養(yǎng)箱沒有搖勻，或者放入時(shí)搖勻，但在細(xì)胞貼壁前，又移動(dòng)了培養(yǎng)瓶，頻繁開關(guān)培養(yǎng)箱引起的振動(dòng)或者培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液過少，培養(yǎng)箱擱板表面不平整，這些因素會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長不均勻。

16、購買的細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。運(yùn)輸過程對細(xì)胞有嚴(yán)重影響。解凍過程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80°C太久。

人卵巢癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 SK-OV-3+LUC

人肝癌細(xì)胞 smmc-7721

人腦膠質(zhì)瘤 SNB-19

人肝癌細(xì)胞 snu-1

人肝癌細(xì)胞 Snu-182

人膀胱上皮永生化細(xì)胞 sv-huc-1

人滑膜肉瘤細(xì)胞 SW982 [SW-982]

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞 SW1116

人腎上腺皮質(zhì)小細(xì)胞癌細(xì)胞 SW-13

人腎上腺皮質(zhì)小細(xì)胞癌細(xì)胞 SW1353

人胰腺癌細(xì)胞 SW1990

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞 SW480

人甲狀腺癌細(xì)胞 SW579

人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞 SW620

人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞+GFP SW620+GFP

人結(jié)直腸癌細(xì)胞氟尿嘧啶耐藥株 SW620/5FU

人膀胱移行細(xì)胞癌 SW780

人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞 T24

人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞 T47D

人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 T98G

人食管癌細(xì)胞 TE-1

人食管癌細(xì)胞 TE-12

人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞 thp-1

人腦膠質(zhì)瘤 TJ905

人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞株 TPC-1

人甲狀腺癌細(xì)胞 TT

人喉癌細(xì)胞 TU212

人喉癌細(xì)胞 TU-138

人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 U118MG（U-118MG）

人成骨肉瘤細(xì)胞 U-2 OS

人類星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞 U251 MG (KO)

人類星形膠質(zhì)瘤耐替莫唑胺細(xì)胞 U251 MG/TMZ

人類星形膠質(zhì)瘤耐替莫唑胺細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 U251 MG/TMZ+LUC(3000)

人骨髓瘤細(xì)胞 U266

人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 U87MG

人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤+RFP U87MG+RFP

人淋巴瘤細(xì)胞 U-937

人膀胱移行細(xì)胞癌 UM-UC-3

人前列腺癌細(xì)胞 VCAP

人視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 WERI-RB-1

人黑素瘤細(xì)胞 WM-115

人正常前列腺基質(zhì)永生化細(xì)胞 WPMY-1

人正常肝細(xì)胞 WRL68

云南宣威人肺腺癌細(xì)胞系+GFP XWLC-05+GFP

人膽囊癌細(xì)胞系 ZJU-0430

人膽囊癌細(xì)胞系熒光素酶標(biāo)記 ZJU-0430+LUC

人乳腺癌細(xì)胞 ZR-75-1

17、細(xì)胞抱團(tuán)怎么處理?

一些懸浮細(xì)胞抱團(tuán)生長是正?，F(xiàn)象，大部分懸浮細(xì)胞在細(xì)胞密度很高的情況下，很可能會(huì)出現(xiàn)部分細(xì)胞抱團(tuán)生長的現(xiàn)象，聚團(tuán)細(xì)胞很容易死亡并演化成絮狀物，殃及周圍的懸浮細(xì)胞，因此在培養(yǎng)懸浮細(xì)胞時(shí)需控制好細(xì)胞密度。如果出現(xiàn)了細(xì)胞團(tuán)，可以通過細(xì)胞篩去掉部分較大的細(xì)胞團(tuán)，也可以嘗試一下方法：將細(xì)胞懸液收集到15 ml離心管中，靜置20 min左右，小心取上層細(xì)胞上清培養(yǎng)(該方法只能去除部分較大的細(xì)胞團(tuán))。

18、細(xì)胞內(nèi)有空泡，是否是正?，F(xiàn)象?

部分細(xì)胞本身存在一定的空泡(如HepG2，Ishikawa及一些耐藥株等)，這個(gè)是正常現(xiàn)象。如果只有少數(shù)細(xì)胞有內(nèi)出現(xiàn)極少空泡，則很可能是細(xì)胞狀態(tài)不佳，可以通過調(diào)整血清濃度，控制消化，控制傳代比例及時(shí)間等方法來調(diào)整細(xì)胞狀態(tài);如果大部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡，且單個(gè)細(xì)胞內(nèi)空泡數(shù)目偏多，則可能細(xì)胞代次較高，細(xì)胞老化所致，需更換代次較早的細(xì)胞。

19、細(xì)胞傳兩代后開始逐漸死亡的原因

很可能是培養(yǎng)體系不適合細(xì)胞(未使用推薦的培養(yǎng)體系);或者消化過度，對細(xì)胞有嚴(yán)重影響;或者是傳代比例不合適(具有密度依賴性的細(xì)胞，傳代太稀;或者生長較快的細(xì)胞，傳代較密，細(xì)胞嚴(yán)重堆疊生長)。

20、細(xì)胞生長逐漸變慢是什么原因?

細(xì)胞增殖變慢有以下原因：1. 消化過度 2. 傳代過密 3.細(xì)胞營養(yǎng)不良 4.細(xì)胞頻繁傳代 5.細(xì)胞狀態(tài)不佳或老化 6.細(xì)胞存在污染。

21、培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5%或10%CO2?

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7 g時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10% CO2;當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5 g時(shí)，則應(yīng)使用5% CO2培養(yǎng)細(xì)胞。

22、CO2培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔?

定期(每周一次)更換水盤里面的水，水盤的水必須使用無菌蒸餾水或無菌去離子，水盤中可添加1%硫酸銅以預(yù)防霉菌污染。

23、細(xì)胞接種密度多少合適?

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長的一個(gè)重要原因。按照我們的經(jīng)驗(yàn)：一般倍增時(shí)間24 h內(nèi)的細(xì)胞，傳代比率1:6-1:12為宜，倍增時(shí)間24-48 h的細(xì)胞，傳代比率1:3-1:8為宜，倍增時(shí)間超過48h的細(xì)胞, 傳代比率1:2-1:4為宜。

24、培養(yǎng)中常出現(xiàn)一些黑點(diǎn)，是污染嗎?

首先肉眼觀察培養(yǎng)液是否變渾濁，如果變渾濁，基本可以確定是污染;如果肉眼觀察培養(yǎng)液沒有變渾濁：在顯微鏡下觀察黑點(diǎn)大小和形狀是否規(guī)則，是否運(yùn)動(dòng)，是做布朗運(yùn)動(dòng)還是呈直線型快速移動(dòng)。如果黑點(diǎn)大小不規(guī)則，做布朗運(yùn)動(dòng)，黑點(diǎn)可能是細(xì)胞碎片(可能是細(xì)胞狀態(tài)不佳或者消化過度引起的)，也可能是血清反復(fù)凍融產(chǎn)生的蛋白沉淀引起的，也可能是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物。如果黑點(diǎn)大小一致，快速移動(dòng)，很可能是細(xì)菌污染。

25、如何預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)中黑點(diǎn)的產(chǎn)生?

掌握細(xì)胞傳代的最佳時(shí)機(jī)，不要細(xì)胞長老了再傳代;掌握好消化時(shí)間，防止消化過度產(chǎn)生細(xì)胞碎片;減少血清等試劑的凍融次數(shù);將培養(yǎng)液的PH調(diào)到最佳;嚴(yán)格控制水質(zhì)和器皿的清潔。

26、黑點(diǎn)已經(jīng)產(chǎn)生了，如何進(jìn)行處理?

如果判定黑點(diǎn)是污染，請及時(shí)將細(xì)胞處理后丟棄。其他情況，可參照以下進(jìn)行：

如果是懸浮細(xì)胞：收集細(xì)胞上清慢速離心(500-600 rpm/min，5-6 min)并更換新的培養(yǎng)瓶;如果是貼壁細(xì)胞：將細(xì)胞用PBS洗2-3遍，洗的時(shí)候，輕輕拍打培養(yǎng)瓶，讓貼壁不牢的碎片和顆粒脫落，再棄去PBS，消化時(shí)先加低濃度的胰酶如0.05%胰酶消化1 min左右，讓細(xì)胞間隙中的顆粒和碎片脫落下來，去掉低濃度胰酶，然后正常消化細(xì)胞，將收集的細(xì)胞懸液慢速離心(500-600 rpm/min，5-6 min)并更換新的培養(yǎng)瓶，并可以嘗試適當(dāng)增加血清濃度進(jìn)行培養(yǎng)。

27、培養(yǎng)用dish,flask是否相同？

不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，雖對大部分細(xì)胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長差異。

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