豬腎細(xì)胞 PK-15

細(xì)胞介紹

從分離自新生的未閹割的豬的空腸的正常腸上皮細(xì)胞建立，該細(xì)胞系攜帶豬C型腫瘤病毒(PCOV)序列及其轉(zhuǎn)錄物，分別通過PCR和RT-PCR檢測(cè)。我們沒有確定這些病毒的感染方式，也不能排除病毒的分泌。在德國(guó)，這些病毒被分類為與人有關(guān)的BSL 1和與動(dòng)物有關(guān)的BSL 2(TRBA 462)。然而，德國(guó)中央生物安全委員會(huì)(ZKBS)將這些病毒和受感染的細(xì)胞系BSL 2歸類為用于基因改造應(yīng)用(參考文獻(xiàn)1。6790-10-65).

細(xì)胞特性

1） 來源：豬  腸(空腸)

2） 形態(tài)：上皮細(xì)胞樣  貼壁生長(zhǎng)

3） 含量：>1x10^6  細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5）用途：僅供科研使用。

三、 細(xì)胞傳代操作步驟

A. 貼壁細(xì)胞傳代

1. 準(zhǔn)備：吸棄舊培養(yǎng)基。

2. 沖洗：沿培養(yǎng)瓶側(cè)壁緩慢加入PBS等沖洗液，輕輕晃動(dòng)后吸棄，去除殘留血清。

3. 消化：加入預(yù)熱的胰酶（如T25加1ml），輕輕晃動(dòng)使胰酶覆蓋所有細(xì)胞。

4. 孵育：室溫消化約2分鐘（時(shí)間因細(xì)胞而異）。

5. 觀察：在顯微鏡下觀察，直至≥90% 細(xì)胞變圓、脫落。若未達(dá)到，可每30秒檢查一次。

6. 終止：當(dāng)細(xì)胞充分解離后，立即加入兩倍胰酶體積的預(yù)熱的wan全培養(yǎng)基終止消化。

7. 吹打：用移液器輕輕吹打瓶壁，使細(xì)胞wan全脫落并分散成單細(xì)胞懸液。

8. 離心：將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，200 × g 離心 3-5分鐘，棄上清。

9. 重懸與接種：用少量新鮮wan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，按適當(dāng)比例稀釋后，接種到新的培養(yǎng)瓶中。

10. 培養(yǎng)：放入培養(yǎng)箱。若使用普通瓶蓋，務(wù)必旋松瓶蓋以利氣體交換。

B. 懸浮細(xì)胞傳代

1. 收集與離心：將細(xì)胞懸液全部轉(zhuǎn)移至離心管，1000 rpm 離心 5分鐘，棄上清。

2. 重懸：加入1-2ml新鮮wan全培養(yǎng)基，輕柔重懸細(xì)胞。

3. 接種：按1:2的比例將細(xì)胞懸液傳至新T25培養(yǎng)瓶，并補(bǔ)充總培養(yǎng)基量至5-8ml。

4. 培養(yǎng)：放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

四、 特殊問題處理：運(yùn)輸中脫落的貼壁細(xì)胞

部分貼壁不牢的細(xì)胞在運(yùn)輸中會(huì)脫落，屬正?，F(xiàn)象，按以下步驟處理：

1. 收集：將瓶?jī)?nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，離心（1200rpm, 3-5min）棄上清。

2. 清洗：用PBS重懸細(xì)胞，再次離心（1200rpm, 3-5min）棄去PBS。

3. 消化：加入約1ml 0.25%胰酶，輕柔混勻（勿劇烈吹打），放入培養(yǎng)箱消化1-2分鐘。

4. 終止與分散：取出后輕輕吹打使細(xì)胞團(tuán)分散，迅速加入3-5mlwan全培養(yǎng)基終止消化，離心（1200rpm, 3-5min）棄上清。

5. 重懸與接種：加入5mlwan全培養(yǎng)基重懸，按比例接種到新培養(yǎng)瓶/皿中。

6. 觀察：鏡下觀察。若細(xì)胞為單顆或僅有3-5個(gè)細(xì)胞的小團(tuán)，可正常培養(yǎng)，待其貼壁生長(zhǎng)。--細(xì)胞凋亡的早期形態(tài)學(xué)改變是核染色質(zhì)濃聚、固縮,聚集在核膜周邊，然后是胞漿濃縮、胞膜起泡,繼而細(xì)胞核裂解成若干碎片，細(xì)胞膜將胞質(zhì)和染色質(zhì)斷片包裹，胞漿內(nèi)形成多個(gè)膜結(jié)構(gòu)尚完整的“小泡"及 “凋亡小體" (apoptoticbody)。這不同于細(xì)胞壞死的細(xì)胞腫脹、胞膜破裂、細(xì)胞崩解。

       根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，至今為止，已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法。

流式細(xì)胞技術(shù)

     流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞是通過檢查其光射特征及熒光參數(shù)時(shí)行的。細(xì)胞穿過流式細(xì)胞儀的激光束集點(diǎn)時(shí)使激光發(fā)生散射，分析散射光可以提供細(xì)胞大小及結(jié)構(gòu)的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光兩種，前向散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞大小、體積相產(chǎn)，右向角射光的強(qiáng)度與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的析射性、顆粒性（granu-larity）有關(guān)。

     細(xì)胞凋亡過程中出現(xiàn)的形態(tài)改變?nèi)缂?xì)胞皺縮、胞膜起泡、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發(fā)生改變。早期凋亡細(xì)胞主要表現(xiàn)為前向散射光減弱而右向角散射光增強(qiáng)或不變，前者反映了細(xì)胞的皺縮，后者反映了細(xì)胞的核逐縮及碎裂。晚期凋亡細(xì)胞的前向散射光和右向角散射光均減弱。

     由于光散射牧場(chǎng)生并非凋亡細(xì)胞的特異性指標(biāo)，細(xì)胞的機(jī)械性損傷和細(xì)胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測(cè)與熒光參數(shù)的檢測(cè)結(jié)合起來才能準(zhǔn)確地辨認(rèn)凋亡細(xì)胞。

     細(xì)胞凋亡過程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解，導(dǎo)致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細(xì)胞熒光染色后作流式細(xì)胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細(xì)胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細(xì)胞。

    根據(jù)此亞二倍體峰可以計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分率。此外，流式細(xì)胞術(shù)還可以通過測(cè)定線粒體膜的電位、溶酶體質(zhì)子泵的活性及細(xì)胞DNA/總蛋白質(zhì)比例等方法辨認(rèn)凋亡細(xì)胞。

檢測(cè)方法：獲取密度1×106細(xì)胞/ml左右的細(xì)胞懸液，精洗，固定，熒光染料染色，上流式細(xì)胞儀分析。

豬腎細(xì)胞 PK-15

小鼠神經(jīng)干細(xì)胞 NE-4C

小鼠胰島β細(xì)胞株 Min6

小鼠B細(xì)胞淋巴瘤 A20

小鼠肝癌細(xì)胞 Hepa1-6

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞 Bv-2

小鼠乳腺癌細(xì)胞 4T1

小鼠胚胎瘤細(xì)胞 ATDC5

小鼠胰腺癌細(xì)胞 PANC02

小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞 GL261

小鼠肺癌細(xì)胞 LLC

小鼠骨肉瘤成骨細(xì)胞 K7M2wt

小鼠乳腺癌細(xì)胞 EMT6

小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞 HT22

小鼠小腸內(nèi)分泌細(xì)胞系 STC-1

小鼠乳腺上皮細(xì)胞 EpH4-Ev

小鼠肝細(xì)胞 AML12

小鼠膀胱癌細(xì)胞 MB49

小鼠巨噬細(xì)胞 Ana-1

小鼠腎小球系膜細(xì)胞 SV40-MES-13

小鼠胚胎肝細(xì)胞 BNLCL.2

小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞 P815

小鼠腎癌細(xì)胞 Renca

小鼠腦神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤瘤株 G422

小鼠骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0

小鼠精原細(xì)胞系 GC-1spg

小鼠腎髓質(zhì)細(xì)胞 mIMCD-3

小鼠前列腺癌細(xì)胞 RM-1

小鼠宮頸癌細(xì)胞 U14

小鼠卵巢癌細(xì)胞 ID8

小鼠皮下結(jié)締組織細(xì)胞 L-WRN

小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞 266-6

小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞　 OP9

小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞 MC3T3-E1

人子宮頸表皮癌細(xì)胞MS751 MS751

小鼠肝癌 H22

小鼠淋巴瘤細(xì)胞 EL4

小鼠骨樣細(xì)胞 MLO-Y4

小鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞 MS1

豬腎傳代細(xì)胞 IBRS-2

恒河猴胚腎細(xì)胞 FRHK-4

恒河猴腎細(xì)胞 LLC-MK2

昆蟲卵巢細(xì)胞 Sf9

科研C6/36白紋伊蚊細(xì)胞 C6/36

猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞 RF/6A

雞肝癌細(xì)胞 LMH

倉(cāng)鼠腎成纖維細(xì)胞 BHK-21

非洲綠猴腎細(xì)胞 VEROC1008(E6)

豬腎細(xì)胞系 PK15

牛腎細(xì)胞 MDBK

非洲綠猴腎細(xì)胞 VERO

豬睪丸細(xì)胞系 ST

貓腎細(xì)胞 CRFK

犬腎細(xì)胞 MDCK-II

恒河猴腎細(xì)胞MA-104 MA-104

絨猴EBV轉(zhuǎn)化的白細(xì)胞 B120-8

豬內(nèi)皮細(xì)胞PED PED

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 CHO-K1

雞胚胎成纖維細(xì)胞 UMNSAH/DF-1

中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞CHL CHL

倉(cāng)鼠肺細(xì)胞 V79

豬肺泡巨噬細(xì)胞 3D4/21

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 CHO

雞淋巴瘤細(xì)胞 DT40

猴腎細(xì)胞 MARC145

鴨子胚胎成纖維細(xì)胞 Duckembryo

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(懸浮 CHO-S

果蠅胚胎細(xì)胞S2 S2

豬腸上皮細(xì)胞 IPEC-J2

 豬鼻甲黏膜成纖維細(xì)胞 PT-K75

豬肺泡巨噬細(xì)胞 3D4/21

 豬腎細(xì)胞 PK-15