豬鼻甲黏膜成纖維細胞PT-K75

細胞介紹

克隆Neuro-2A是由R.J.Klebe和F.H.Ruddle經(jīng)A株白鼠的自生腫瘤建立。該細胞產(chǎn)生大量微管蛋白，此蛋白在神經(jīng)細胞中起應(yīng)答軸漿流動的收縮系統(tǒng)作用。

細胞特性

1） 來源：腦神經(jīng)母細胞瘤

2） 形態(tài)：阿米巴樣干細胞

3） 含量：>1x10^6  細胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用。

凍存細胞的復(fù)蘇：：

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：

棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3）細胞凍存: 收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。下面T25瓶為例；

1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

細胞凋亡的早期形態(tài)學改變是核染色質(zhì)濃聚、固縮,聚集在核膜周邊，然后是胞漿濃縮、胞膜起泡,繼而細胞核裂解成若干碎片，細胞膜將胞質(zhì)和染色質(zhì)斷片包裹，胞漿內(nèi)形成多個膜結(jié)構(gòu)尚完整的“小泡"及 “凋亡小體" (apoptoticbody)。這不同于細胞壞死的細胞腫脹、胞膜破裂、細胞崩解。

       根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征，至今為止，已經(jīng)設(shè)計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學檢測方法。

流式細胞技術(shù)

     流式細胞儀檢測凋亡細胞是通過檢查其光射特征及熒光參數(shù)時行的。細胞穿過流式細胞儀的激光束集點時使激光發(fā)生散射，分析散射光可以提供細胞大小及結(jié)構(gòu)的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光兩種，前向散射光的強度與細胞大小、體積相產(chǎn)，右向角射光的強度與細胞結(jié)構(gòu)的析射性、顆粒性（granu-larity）有關(guān)。

     細胞凋亡過程中出現(xiàn)的形態(tài)改變?nèi)缂毎櫩s、胞膜起泡、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發(fā)生改變。早期凋亡細胞主要表現(xiàn)為前向散射光減弱而右向角散射光增強或不變，前者反映了細胞的皺縮，后者反映了細胞的核逐縮及碎裂。晚期凋亡細胞的前向散射光和右向角散射光均減弱。

     由于光散射牧場生并非凋亡細胞的特異性指標，細胞的機械性損傷和細胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測與熒光參數(shù)的檢測結(jié)合起來才能準確地辨認凋亡細胞。

     細胞凋亡過程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解，導(dǎo)致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細胞熒光染色后作流式細胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細胞。

    根據(jù)此亞二倍體峰可以計算凋亡細胞的百分率。此外，流式細胞術(shù)還可以通過測定線粒體膜的電位、溶酶體質(zhì)子泵的活性及細胞DNA/總蛋白質(zhì)比例等方法辨認凋亡細胞。

檢測方法：獲取密度1×106細胞/ml左右的細胞懸液，精洗，固定，熒光染料染色，上流式細胞儀分析。

豬鼻甲黏膜成纖維細胞PT-K75

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